Ефективність швидких імунохроматографічних тестів в діагностиці ВІЛ-інфекції в Україні

Відповідно до результатів епідеміологічних спостережень у структурі груп ризику підвищеної захворюваності на ВІЛ-інфекцію/СНІД в Україні 68 % займають споживачі ін’єкційних наркотиків, росте відсоток інфікованих статевим шляхом їх сексуальних партнерів, насамперед жінок, і, як наслідок, збільшується кількість ВІЛ-інфікованих новонароджених дітей. В цьому плані ВІЛ-інфекція/СНІД загрожує існуванню нації, адже переважна більшість ВІЛ-інфікованих – це особи працездатного та репродуктивного віку. Високий рівень ризикованої поведінки у поєднанні з низьким рівнем інформованості населення та недостатнім фінансуванням лікувально-профілактичних закладів свідчать, що епідемія ВІЛ-інфекції/СНІД поширюється в Україні без будь-яких ознак до стабілізації [4, 13, 14].

Багато питань, пов’язаних із стратегією і тактикою лабораторного моніторингу за ВІЛ-інфікованими знаходяться сьогодні на стадії розробки.

Для забезпечення дослідження зразків крові на ВІЛ в Україні у 1987 році Міністерством охорони здоров’я (МОЗ) була створена мережа діагностичних лабораторій. В основу лабораторної діагностики були покладені серологічні дослідження, які базуються на визначенні сумарного спектру антитіл до антигенів ВІЛ за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) з подальшим підтвердженням наявності специфічних антитіл при застосуванні відповідного алгоритму досліджень. Ці дослідження проводяться  відповідно з «Інструкцією з організації роботи лабораторії діагностики ВІЛ-інфекції», яка затверджена Наказом МОЗ України N 71 від 22.02.2002 року [ 8 ]. ІФА – високочутливий та специфічний метод дослідження, який добре зарекомендував себе впродовж 20 років [1, 5, 10]. Але для його виконання необхідна відповідним чином обладнана спеціалізована лабораторія, дороге обладнання, апаратура та персонал, який має високу кваліфікацію. Враховуючи особливості проведення ІФА та його оптимізацію під великі об’єми, матеріал для дослідження, переважно, збирають декілька днів. Таким чином результат дослідження стає відомим через декілька днів [12, 15, 16]. Стратегія наближення медичних установ до пацієнта, тобто наявність медико-профілактичних закладів амбулаторного типу у територіально віддалених районах, де відсутні устатковані лабораторії, необхідність надання медичної допомоги потребує розробки і застосування більш простих у виконанні, але достатньо чутливих та специфічних методів лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції/СНІДУ. Сьогодні такі швидкі тести випускають багато фірм-виробників. Впровадження швидкої діагностики на основі імунохроматографічного аналізу підтримують ВООЗ і Глобальний фонд, вона рекомендує для застосування в міжнародних програмах по контролю за хворобами, що передаються статевим шляхом, в програмах, пов’язаних з ВІЛ-інфекцією/СНІД та іншими [2, 3, 6 ,7 ,9, 17]. У Росії діагностика інфекційних хвороб із застосуванням зазначених швидких тестів проводиться протягом майже 10 років. За цей період основними споживачами були, насамперед, організації самостійних форм діяльності, консультативні кабінети, сімейні лікарі, лікарі швидкої та невідкладної медичної допомоги. Все більшу зацікавленість до швидких тестів проявляють керівники державних медичних установ і закладів, що мають не досить забезпечені лабораторії. Саме за цих умов нашу увагу привернули до себе  зареєстровані в Україні діагностичні набори «Сito Test HIV ½» фірми «Фармаско» [11]. Тести проводяться прямо на місці, не вимагають транспортування матеріалу, його відповідної презентації та зберігання в лабораторії. Основними перевагами цих діагностичних наборів є простота і зручність у застосуванні, відсутність необхідності у дорогому обладнанні, швидкість отримання результату (15 хвилин) та легкість його інтерпретації. Перевагою є також можливість тестування лише одного зразка, що особливо важливо при невеликій кількості досліджень, неефективності організації стаціонарної лабораторії або у позаштатних ситуаціях [2, 3, 6, 9]. При використанні цих тестів значно простіше забезпечити конфіденційність та анонімність обстеження. У той же час, розуміючи особливості національного фармацевтичного ринку компанія пропонує діагностичні набори споживачу за відносно доступною ціною.

Метою нашої роботи було вивчення діагностичної ефективності нових ІХА-тестів “Cito Test HIV ½” фірми «Фармаско» для визначення антитіл до ВІЛ ½ у цільній крові, сироватці, плазмі.

Всього на кафедрі вірусології було досліджено 300 зразків сироваток крові, з яких 100 зразків містили антитіла до ВІЛ ½. Це сироватки ВІЛ-інфікованих осіб, які перебували на диспансерному обліку у міському центрі профілактики і боротьби з ВІЛ-інфекцією/СНІД та ВІЛ-інфікованих дітей, які знаходились на лікуванні на кафедрі дитячих інфекційних хвороб та дитячої імунології  КМАПО. 200 зразків сироваток крові, які не містили антитіла до ВІЛ ½, отримані з міського центру крові від здорових донорів після попереднього їх тестування на наявність антитіл до ВІЛ ½ на 2 тест-системах: DIA-HIV ½ (“Dia•Proph•Med”, Україна) та Genscreen  HIV ½ (Bio Rad, Франція).

Враховуючи, що ІХА - це швидкий якісний метод, направлений на визначення наявності у цільній крові, сироватці, плазмі антитіл до вірусу імунодефіциту людини 1 та 2 типів, одержані цим методом позитивні результати нами були підтверджені в ІФА з використанням діагностичних тест-систем, зареєстрованих в Україні [7, 11].  При виборі методу порівняння ми також враховували принцип будови тестів і те, що метод імунної хроматографії заснований на візуалізації реакції зв’язування антитіл зі специфічним антигеном. При цьому рекомбінантні антигени, кон’юговані з барвником (колоїдним золотом (КЗ)), у випадку наявності у зразку відповідних антитіл концентрувались у певному місці (на смузі), що чітко видно неозброєним оком (рис. 1).

[ 1]

Дослідження проводили таким чином: після внесення зразка сироватки в зону S (sаmplе) тест-касети, мембрана змочувалась і відбувалась дифузія антитіл до ВІЛ ½ (за їх наявності у зразку) та антигенів ВІЛ, мічених КЗ. Утворений імунний комплекс     «рекомбінантний ВІЛ ½ антиген + КЗ – антитіло ВІЛ ½» під дією капілярної сили хроматографічно просувався удовж мембрани, досягав місця розташування рекомбінантних антигенів ВІЛ на мембрані у зоні Т і знову імунологічно взаємодіяв з останніми, що призводило до формування специфічних імунних комплексів і накопиченню барвника. У зоні Т з’являлась чітка лінія червоного кольору. Наявність червоної смуги в тестовій зоні свідчило про те, що зразок містив антитіла до ВІЛ ½ (результат позитивний); відсутність тестової лінії вказувало на те, що зразок не містив антитіла (результат негативний). Подальша дифузія зазначених імунних комплексів або (за відсутності антитіл до ВІЛ ½ у зразку) кон’югату рекомбінантного антигену ВІЛ ½ з КЗ до зони контролю С призводила до утворення контрольної червоної лінії, яка виступала як вбудована внутрішня система контролю тесту. Поява червоної контрольної лінії підтверджувала, що нами був використаний достатній об’єм сироватки та дотримані всі необхідні умови постановки тесту. Відсутність контрольної лінії С незалежно від появи або відсутності результативної лінії Т свідчила про те, що була використана недостатня кількість зразку або невірно дотримана процедура тесту (результат недійсний). В такому випадку тест повторювався, з новою тест-касетою. Облік результатів тесту проводили візуально через 15 хвилин у присутності 2 осіб. Появу тестової лінії будь-якого відтінку червоного кольору розглядалась як позитивний результат. Методика постановки та обліку результатів схематично подані на рис. 2. 

[2]

Для визначення чутливості та специфічності ІХА-тестів нами використовувались “Cito Test HIV ½ ”, с. HIV 30707, exp: 2005-07, надані фірмою «Фармаско». Чутливість та специфічність ІХА-тестів досліджували у порівнянні з ІФА (еталонне дослідження). В якості еталона нами була обрана тест-система 3 покоління, імуноферментна плашкова для виявлення антитіл до вірусу імунодефіциту людини 1 та 2 типів «DIA-HIV ½» (НВО “Dia•Proph•Med”, Україна). Проведення досліджень методом ІФА здійснювали у відповідності з інструкцією до тест-системи. Промивання планшетів проводили за допомогою автоматичного промивача «WELLWASH 4Mk-2» («Thermo Electron», Фінляндія). Облік результатів ІФА здійснювали у двохвильовому режимі 450/620 нм за допомогою спектрофотометра «MULTISKAN ASCENT» («Thermo Electron», Фінляндія).

Чутливість методу розраховували за формулою [10]:

Чутливість  =                 дійснопозитивні результати  ІХА         ×  100 % ;

                       дійснопозитивні результати ІХА  +  хибнонегативні

Специфічність розраховували за формулою [10]:

Специфічність  =             дійснонегативні результати ІХА            × 100 %

                        дійснонегативні результати ІХА +  хибнопозитивні

При паралельному тестуванні на наявність антитіл до ВІЛ ½ 100 сироваток крові, котрі містили відповідні антитіла, всі 100 зразків в ІФА  дали позитивний результат, а при використанні швидких ІХА-тестів нами отримано позитивні результати в 98 сироватках крові. Таким чином, виявлено 2 хибнонегативних результати при дослідженні зразків в ІХА. Слід зазначити, що з 98 випадків позитивних результатів ІХА наявність чіткої яскравої червоної лінії спостерігалась у 83 випадках (84,7 %); у  15,3% лінії були менш інтенсивними за кольором та оцінені як рожеві.          При паралельному тестуванні 200 зразків сироваток крові, які не містили антитіла до ВІЛ ½, за допомогою еталонного методу та ІХА-тестів, у 100 % випадків результати співпадали та інтерпретувалися, як «негативні».

Чутливість ІХА-тестів, згідно наших досліджень, склала 98 %, специфічність-100%.

Слід підкреслити, що отримані показники чутливості та специфічності дещо відрізняються від заявлених в інструкції виробником. (чутливість – 99,9% , специфічність – 99,6%). Це пояснюється особливостями вибірки в даному дослідженні, і відносно невеликою кількістю проведених досліджень в порівнянні с дослідженнями виробника.

Таблиця  

Чутливість та специфічність
імунохроматографічного аналізу для визначення антитіл до ВІЛ ½

Проведене вивчення швидких ІХА-тестів для визначення антитіл до ВІЛ ½ «Сito Test HIV ½» фірми «Фармаско» дає підстави стверджувати про доцільне їх використання при необхідності отримання швидких результатів скринінгу за умов обмежених лабораторних можливостей.               Простота у використанні, можливість швидкого отримання результату, як при поодиноких дослідженнях так і у великому їх потоці,   роблять ці тести перспективними в ургентних умовах, в практиці сімейного лікаря, під час прийняття рішення щодо надання екстренної постконтактної профілактики медичному представнику при його контакті з кров’ю ВІЛ-інфікованого.

Одержані за допомогою ІХА-тестів позитивні результати повинні бути підтверджені в ІФА за допомогою діагностичних тест-систем 3-4 покоління, зареєстрованих в Україні, у спеціалізованих лабораторіях з діагностики ВІЛ-інфекції.

ЛІТЕРАТУРА

1. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение (2-е издание, исправленное и дополненное) /В.В. Покровский, Т.Н. Ермак, В.В. Беляева, О.Г. Юрин.-М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.- С. 282-316.

2. Возианова Ж.И., Корчинский Н.Ч. Экспресс-диагностика вирусного гепатита В //Сучасні інфекції.- 2001.-N1.-С.112-116.

3. Возіанова Ж.І., Голубовська О.А., Корчинський Н.Ч. Експрес-визначення деяких маркерів вірусних гепатитів В і С //Лаб.діагностика.-2005.-N 4.- С.56-59.

4. Доповідь щодо глобальної епідемії ВІЛ/СНІДу, UNAIDS, 2005.

5. Ефективність застосування комбінацій імуноферментних тест-систем при верифікаційних дослідженнях на антитіла до ВІЛ /О.М. Кислих, О.В. Максименок, Т.А.Сергеєва, А.Л. Гураль //Лаб. діагностика.-2004.-N 4.- С. 18-23.

6. Зайцев І.А., Мірошниченко В.А. Швидкі тести у діагностиці вірусних гепатитів з парентеральним механізмом передачі збудника //Лаб. діагностика.-2005.-N 2.- С.41-43.

7. Застосування швидких тестів у лабораторній діагностиці інфекційних хвороб /В.П. Широбоков, І.В. Дзюблик, С.Г. Вороненко та співавт. - Методичні рекомендації.-К: 2004.-32 с.

8. Інструкція з організації роботи лабораторії діагностики ВІЛ-інфекції, затверджена Наказом МОЗ України N 71 від 22.02.2002р.

9. Каминский В.В., Кравец А.А. Методы диагностики вирусного гепатита С при обследовании беременных //Репродуктивное здоровье женщины.-2003.-N 4 (16).- С.7-8.

10. Навчальний посібник з лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції/СНІДу /В.М. Гирін, І.В. Дзюблик, В.Г. Порохницький та співавт. – К.: 1999.-160 с.

11. Наказ МОЗ України № 467 від 23.09.2004 р. «Про затвердження методичних рекомендацій щодо застосування швидких тестів для перевірки крові на інфекційні хвороби, облікової форми та інструкції щодо її заповнення».

12. Помилки імуноферментної діагностики /О.М. Кислих, О.В. Максименок, Т.А. Сергеєва, В.Р. Шагінян //Лаб. діагностика.-2005.- N4.- С.43-49.

13. Розвиток епідемії СНІДу: стан на грудень 2005 року UNAIDS/WHO, 2005.

14. Щербінська А.М., Люльчук М.Г. СНІД - проблеми і перспективи, від розуміння до протидії //Журнал практичного лікаря.-2001.- N1.-С. 2-5.

15. Faulty washers and solid micropipettors may generate false positive serological results /J.V. Parry, P.P. Mortimer, P. Friderich, J.A. Connell//Clin. Diagnost. Virol.-1997.-Vol.7, N3.-P. 173-181.

16. Fiers W. Basis problems of serological laboratory diagnosis //Molec. Biotechnol.-1999.-Vol.13.-P.89-111.

17. Torlesse H.,  Wurie I.M., Hodges M. The use of immunochromatography test cards in the diagnosis of hepatitis B surface antigen among pregnant women in West Africa //Br. J. Biomed. Sci.-1997.-Vol.54.-P. 256-259.

18.  http://www.aidsalliance.org/.